на главнуюнаписать письмо
Справочники
препараты наших спонсоров





Вход администратора:
Логин:
Пароль:
Забыли пароль?
30.12.2017

Определение генетического полиморфизма (-13910)C>T MCM6 как диагностический инструмент для выявления непереносимости лактозы

М.А. Прасолова 1,2, c.н.с.

 

Н.А. Вайшля 1, к.б.н., ст. микробиолог

 

М.К. Иванов 1,3, к.б.н., зав. лабораторией

 

1  ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск

 

2  Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

 

3  Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

 

Источник:

http://www.poliklin.ru/

 

Полный текст статьи:

http://www.poliklin.ru/imagearticle/20154(1)LAB/72-76.pdf

 

 

Журнал «Поликлиника», спецвыпуск № 7, 2015 «ЛАБОРАТОРИЯ ЛПУ», с. 72-76

 

Три четверти населения земного шара во взрослом состоянии не способны усваивать молочный сахар и могут страдать от желудочно-кишечных расстройств при потреблении молока. Результат генетического анализа на полиморфизм (-13910) C>T гена MCM6 является хорошим индикатором присутствия непереносимости лактозы. Нами проведена разработка и апробация нового набора реагентов для определения генетического полиморфизма (-13910) C>T гена MCM6 методом ПЦР с анализом кривых плавления.

 

Ключевые слова: полиморфизмы, непереносимость лактозы, MCM6, ПЦР-диагностика

 

 

Лактоза – сахар, который в большом количестве содержится в молоке и необходим для нормального роста ребёнка. После рождения и на период грудного вскармливания в кишечнике детей синтезируется фермент, лактаза, расщепляющий лактозу до глюкозы и галактозы, которые уже, в свою очередь, потребляются клетками для получения энергии. Для многих людей на земном шаре и для подавляющего большинства млекопитающих после некоторого периода (для человека обычно в возрасте от 2 до 12 лет) характерно значительное падение лактазной активности, и у взрослых лактоза практически не перерабатывается. В то же время, для части людей активность лактазы остаётся стабильно высокой на протяжении всей жизни [7, 9].

 

Гиполактазия (слабая активность лактазы) может в некоторых случаях никак не проявляться, но часто поступление молочного сахара может сопровождаться кишечными расстройствами и в этом случае говорят о непереносимости лактозы. Непереваренная лактоза действует на стенки кишечника, вызывая повышенное отделение воды, как при диарее, а также является пищей для кишечных бактерий, которые в качестве продуктов метаболизма могут выделять газы (H2, CO2, метан), вызывая вздутие живота и метеоризм. Такие симптомы могут мимикрировать под синдром раздражённого кишечника, пищевую аллергию и др., с которыми требуется дифференциальный диагноз. Степень проявления симптомов при непереносимости лактозы варьирует в зависимости от индивидуальных особенностей человека и от состояния кишечной микрофлоры. Обычно употребление небольшого количества молока (до стакана в день) переносится без неприятных последствий. Кисломолочные продукты при гиполактазии усваиваются нормально, так как в них весь молочный сахар уже переработан микроорганизмами. Также показано, что при употреблении молочных продуктов негативный эффект непереносимости лактозы проявляется в меньшей степени, если продукт одновременно содержит большое количество сахарозы (например, сгущённое молоко, мороженое) [7, 9]. Поскольку непереносимость лактозы у индивида обычно приводит к снижению потребления им молочных продуктов, то вместе с ними снижается и поступление кальция в организм, что, соответственно, может приводить к развитию остеопороза. Лицам с непереносимостью лактозы рекомендуется принимать препараты кальция для снижения риска остеопороза [1, 5, 9].

 

Непереносимость лактозы в целом является популяционной нормой, у ¾ населения земного шара во взрослом состоянии лактаза не работает. Однако, в ряде популяций в связи с активным развитием животноводства и длительной историей использования

молочных продуктов в качестве важной части пита-тельного рациона распространились генетические мутации, позволяющие не выключать экспрессию лактазы в течение всей жизни. Самый распространён-ный мутантный гаплотип содержит 2 нуклеотидные замены (-13910) C>T (rs -182549) и (-22018) G>A

 

в регуляторной (энхансерной) области гена LCT, рас-положенной достаточно далеко от самого гена LCT. Данные замены попадают в 13й и 9й интроны гена MCM6. Соответственно, можно встретить варианты названия полиморфизма как (-13910) C>T LCT, так и (-13910) C>T MCM6. Две указанные замены обра-зуют один гаплотип (т.е. наследуются всегда вместе), ассоциированный с постоянным включением гена LCT. При помощи микросателлитного анализа было пока-зано, что соответствующий гаплотип охватывает ещё большую область хромосомы в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов и начал распространяться среди лю-дей около 9 тысяч лет назад. Данный гаплотип возник предположительно независимо в европейской и в африканской популяциях и широко распространился ввиду селективного преимущества при одомашни-вании животных и употребления молока взрослыми [2, 4, 7, 9, 10]. В некоторых исследованиях показана значимая ассоциация аллеля (-13910) T с высоким ростом [3]. Лактоза усваивается всеми носителями мутантных аллелей, как гетерозиготных, так и гомозиготных. Однако, отмечено, что у гетерозигот повышен риск развития вторичной непереносимости лактозы. У гомозигот (-13910) T молоко усваивается хорошо [8, 9].

 

В        африканских популяциях обнаруживаются также ещё 3 аллеля, приводящие к активации экспрессии лак-тазы (-14010) С, (-13907) С и (-13915)G, что демонстрирует пример конвергентной эволюции. Показано, что мутация (-13910)C>T также возникала в разных популяциях европеоидов независимо в разное время. В популяциях арабов и бедуинов Среднего Востока обнаруживается ещё 1 мутантный гаплотип (-3712)C и (-13915)G MCM6, распространение которого связано с

 

 употреблением не коровьего, а верблюжьего молока. Первичную непереносимость лактозы, связанную с низкой активностью лактазы у взрослых, следует отличать от случаев врождённого дефицита лактазы (редкого генетического заболевания, проявляющегося сразу с рождения), а также от случаев вторичной непереносимости лактозы, вызванной например глютеновой болезнью, инфекционным энтеритом, болезнью Крона и др. [9].

 

Существуют прямые функциональные тесты для выявления толерантности к лактозе. Один из них – мониторинг уровня глюкозы в крови после лактозной нагрузки, его увеличение означает, что лактоза была расщеплена и усвоилась организмом, если уровень глюкозы не меняется, значит, лактоза не смогла перевариться. Другой метод основан на измерении выдыхаемого водорода после потребления лактозы, увеличение говорит об активной ферментации лактозы кишечными бактериями и, значит, сам организм её переварить не смог. Водородный тест считается более точным, но и он имеет свои ограничения, избыточный рост бактерий может быть не связан с поступлением лактозы, не всегда в кишечнике есть водород-синтезирующие бактерии и т.д. [6, 7, 8].

 

Генетический тест на наличие полиморфизма (-13910) C>T MCM6 позволяет напрямую выявлять одну из наиболее распространенных причин развития лактозной непереносимости, а не её последствия. Показана хорошая корреляция наличия генотипа (-13910) СС с положительными результатами H2-теста, предсказательная ценность генотипирования для выявления непереносимости лактозы очень высока [4, 6, 8].

 

Целью данной работы была разработка и апробация набора реагентов для определения генетического полиморфизма (-13910) C>T MCM6, пригодного для внедрения в клиническую практику.

 

Материалы и методы

Для апробации набора использовали образцы цельной крови (n=137), буккального эпителия (n=99) и слюны (n=15) добровольцев, жителей Новосибирска и Новосибирской области. Образцы цельной крови взяты из коллекции ЗАО «Вектор-Бест». Образцы слюны и буккального эпителия получены от добровольцев-сотрудников ЗАО «Вектор-Бест». Из них для 76 сотрудников проведено анкетирование на предмет их отношения к молочным продуктам.

Образцы буккального эпителия предварительно ресуспендировали в 300 мкл транспортного раствора (ЗАО «Вектор-Бест»). Образцы цельной крови подвергали предварительной обработке с помощью набора «РеалБест Гемолитик». Далее выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора реагентов «Реал-Бест Экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест») из 100 мкл слюны или суспензии клеток буккального эпителия, либо из осадка ядер, полученных после обработки цельной крови гемолитиком.

 

Готовую реакционную смесь, содержащую все необходимые компоненты для проведения ПЦР, подвергали лиофильному высушиванию. Для предупреждения внутрилабораторной контаминации в смесь вводили дезоксиурацил и фермент урацил-ДНК-гликозилазу. С помощью программ Visual OMP (DNA Software, Inc.) и OligoAnalyzer (IDT, Inc., http://eu.idtdna.com) осуществляли дизайн олигонуклеотидов, подбирая их таким образом, чтобы они не образовывали стабильных димеров между собой и с другими последовательностями исследуемых локусов, а также не имели гомологии с другими участками генома человека.

Принцип анализа, применяемый в наборе реагентов «РеалБест-Генетика MCM6» (ЗАО «Вектор-Бест»), аналогичен описанному нами ранее [11]. Определение генетического полиморфизма, присутствующего в исследуемом образце НК, проводится путём измерения температуры плавления дуплексов флуорогенных зондов и продуктов амплификации целевого участка гена.

 

Амплификацию и детекцию проводили на термоциклере с оптическим модулем «СFX-96» («Bio-Rad», США) и на приборе «ДТпрайм». Температурный режим:

 

Подробнее см. http://www.poliklin.ru/imagearticle/20154(1)LAB/72-76.pdf

 

Результаты и обсуждение

 

В          результате тестирования олигонуклеотидов и проведения оптимизации по составу реакционной смеси был выбран вариант, для которого при анализе гомозиготных образцов (-13910) СС для зонда получался пик плавления при температуре 48 °С, при анализе гомозиготы (-13910) TT – 56 °С. Для гетерозиготного образца характерно наличие обоих пиков. Пример получаемых на разных приборах графиков кривых плавления представлен на рис. 1.

 

Для 24 образцов цельной крови и 16 образцов буккального эпителия провели параллельное тестирование с помощью разработанного нами набора реагентов и зарегистрированного в РФ набора «Генетика Метаболизм лактозы» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва), все результаты полностью совпали. Ещё для 10 образцов цельной крови и 10 образцов буккального эпителия правильность определения генотипа (-13910) С/T MCM6 с использованием нового набора «РеалБест-Генетика MCM6» была подтверждена секвенированием соответствующих локусов ДНК.

 

В        результате апробации набора реагентов «Реал-Бест-Генетика MCM6» на 251 клиническом образце было показано, что частота встречаемости аллеля 13910T в исследованной группе жителей г. Новосибирска и Новосибирской области составила 0,37. Это больше, чем в среднем в мире, но меньше, чем в среднем для европеоидов (таблица 1). Встречаемость аллеля 13910T заметно варьирует между разными европейскими популяциями, например, у британцев в Англии

 

и  Шотландии она составляет 0,72, а для тосканцев в Италии – 0,09 (по данным базы Ensembl, http:// grch37.ensembl.org). Наблюдаемое для обследованной группы людей распределение генотипов соответствовало ожидаемому при соблюдении равновесия Харди-Вайнберга (p=0,588).

 

Для части людей из выборки был проведён опрос, сколько молока они пьют и испытывали ли они при потреблении молочных продуктов неприятные ощущения в животе, вздутие, диарею. Все респонденты были поделены на 3 группы по количеству потребляемого молока:

1) пьют много – более стакана в день в чистом виде;
2) пьют мало – менее стакана в день и в основном в составе каш, пюре, с чаем/кофе и проч.;

3) не потребляют совсем.

Также опрашивали, употребляют ли респонденты сладкие молочные продукты (мороженое, сгущённое молоко). Результаты опроса и генотипы для обследованной выборки сведены в таблице 2.

http://www.poliklin.ru/imagearticle/20154(1)LAB/72-76.pdf

 

 

Видно, что в группе людей с генотипом CC значительно больше доля людей, не пьющих молоко совсем (OR=24,0; CI=6,1–95,0), и людей с фенотипом непереносимости лактозы, для которых употребление молока приводит к кишечным расстройствам (OR=17,6; CI=5,0–61,8). Часть людей с генотипом CC с непереносимостью лактозы (но не все), тем не менее, могут потреблять молочные продукты с сахаром. Это согласуется с литературными данными, согласно которым, кишечная микрофлора менее бурно реагирует на лактозу в присутствии других источников питания [9]. В группах с генотипами CT и TT больше людей потребляют много молока (OR=14,2; CI=4,3–47,6), и они реже имеют проблемы с пищеварением или неприятные ощущения в животе при приёме молочных продуктов, все хорошо усваивают молоко с сахаром.

В нашей выборке встретились люди с CC-генотипом, но употребляющие молоко и/или не испытывающие при этом дискомфорта. По данным литературы случаи, когда у носителей генотипа CC

 

лактоза действительно усваивается (положительный глюкозный тест и отрицательный H2-тест), довольно редки. Более типична ситуация, когда человека, не переваривающего лактозу, не беспокоят симптомы непереносимости. Это может быть связано с психо-соматическими особенностями человека (насколько человек обращает внимание на происходящее внутри организма и чувствительность к дискомфорту) [7]. Так, в нашей выборке из 12 человек с CC генотипом, пьющих молоко, 6 никогда не задумывались, были ли у них какие-то неприятные ощущения в животе на фоне потребления молочных продуктов, ещё 3 – замечали время от времени признаки кишечного расстройства, но пить молоко продолжали. Также для разных людей разные дозы лактозы могут оказаться критичными для развития симптомов непереносимости [9]. В нашей выборке из 4 человек с CC генотипом, которые заявили, что никогда не имели проблем с усвоением молока, 2 обычно совсем не пьют молоко как самостоятельный продукт, ещё 2 пьют время от времени не каждый день.

 

Не все носители «благоприятного» аллеля (-13910) T употребляют молоко, что не говорит, однако, о его непереносимости: некоторым просто не нравится его вкус, у кого-то в семье традиционно не пьют молоко. Несколько респондентов отмечали неприятные ощущения в животе при потреблении молока, но это могло быть связано не с лактозой, а, например, с молочными жирами (отмечено, что хуже переносилось цельное деревенское коровье молоко, но не пастеризованное с пониженным содержанием жира). Также похожий на непереносимость лактозы фенотип может проявляться независимо от потребления молочных продуктов и отражать в большей степени состояние микрофлоры кишечника. Так, в работе Kerber et al. [8] среди носителей аллеля (-13910) T также встречались пациенты с положительным результатом H2-теста, но из них у части людей с CT и всех людей с TT генотипом при подробном исследовании был выявлен синдром избыточного роста бактерий тонкой кишки, что могло явиться причиной вторичной лактозной непереносимости. При этом отмечено, что число случаев вторичной непереносимости лактозы среди носителей гено-типа CT зависит от возраста и заметно выше в группе людей старше 30 лет по сравнению с более молодыми.

 

В         целом, корреляция результатов функциональных тестов на непереносимость лактозы и ДНК-тестирования довольно высока. Позитивная предсказательная ценность (соответствие выявления CC-генотипа  и положительных результатов H2-теста) по данным литературы 97% [6, 8] – 100% [4]; негативная предсказательная ценность для переносимости лактозы (корреляция наличия CT или TT генотипов и отрицательного H2-теста) – 72% [8], 86% [6], 100% [4]. Таким образом, генетический анализ на полиморфизм

(-13910) С/T MCM6 является хорошим и удобным инструментом в клинической практике для диагностики лактозной непереносимости как в качестве самостоятельного теста, так и в дополнение к функциональным тестам. При этом ДНК-тестирование имеет невысокую стоимость, высокую пропускную способность, менее громоздко и более удобно в исполнении, пациенту не надо тратить много времени на исследование и не требуется особая подготовка перед взятием анализа.

 

Заключение

 

Врезультате проведённых исследований разработан и апробирован новый набор реагентов «РеалБест-Генетика MCM6», предназначенный для определения однонуклеотидного полиморфизма (-13910) C>T MCM6. Испытания набора показали, что он обеспечивает точное определение всех генотипов полиморфизма (- 13910) C>T MCM6 в различных типах клинических образцов, а полученные при этом экспериментальные данные хорошо совпадают с литературными данными по связи генотипов с непереносимостью лактозы.

 

Набор реагентов «РеалБест-Генетика MCM6» может применяться в клинической практике для выявления лактозной непереносимости; даёт легко интерпретируемые результаты и обладает высокой производительностью. Данный набор может быть успешно использован в лабораториях, оснащённых амплификаторами с детекцией результатов в режиме реального времени, такими как «CFX96 Real-Time PCR Detection System» («Bio-Rad», США) или «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», г. Москва). В настоящее время набор проходит государственную регистрацию.

 

Список литературы см. здесь:

http://www.poliklin.ru/imagearticle/20154(1)LAB/72-76.pdf

 

 

Вернуться к списку статей

Специалистам
пищевод, желудок, 12-перстная кишка
кишечник
поджелудочная железа
печень, желчевыводящие пути
кожа
пищевод, желудок, 12-перстная кишка
кишечник
поджелудочная железа
печень, желчевыводящие пути
общие вопросы
фармакотерапия
фитотерапия
гомеопатия
все права защищены, при использовании материалов ссылка на сайт обязательна